Gamboni karjäär algas 1962. aastal tema kodulinnas Dublinis, kus ta astus üles Gate Theatre'i lavastuses "Othello", vahendas Variety. Aasta hiljem sai ta rolli ka lavastuses "Richard III", kus teda pani tähele National Theatre'i uusi näitlejaid otsiv Laurence Olivier. Kuni 1980. aastate lõpuni oligi ta põhiliselt tuntud just teatrinäitlejana, muuhulgas on ta astunud korduvalt üles ka Broadway laval ning pälvinud oma teatritööde eest kolm Olivier' auhinda.

Kuigi ta astus filmides üles ka juba varem – näiteks õudusfilmides "Nothing But the Night" (1973) ja "The Beast Must Die" (1974) ja John Irvini draamas "Turtle Diary" (1985) –, tegi ta oma suurema läbilöögi just Peter Greenaway filmist "The Cook, the Thief, His Wife & Her Lover", millele järgnesid Michael Manni poliitiline draama "The Insider" (1999), Tim Burtoni õudusfilm "Sleepy Hollow" (1999) ja vestern "Open Range" (2003).

Eriti aktiivne oli ta filminäitlejana just 2000. aastate alguses. 2004. aastal astus ta üles kokku viies filmis, nende hulgas Wes Andersoni "The Life Aquatic with Steve Zissou", Matthew Vaughni lavastajadebüüt "Layer Cake" ja "Harry Potter ja Azkabani vang", kus ta võttis Albus Dumbledore'i rolli üle Richard Harriselt, kes suri 2002. aastal.

Ta astus üles kõigis järgnevates "Harry Potteri" filmides, hiljem on tema tähelepanuväärsemad rollid olnud ka Tom Hooperi parima filmi Oscariga pärjatud "Kuninga kõnes", kus ta astus üles George V osas, samuti osatäitmised vendade Coenite filmis "Hail, Caesar!" ja mõlemas "Paddingtoni" linaloos. Oma viimase filmirolli tegi ta 2019. aastal filmis "Judy".

2002. aastal oli ta rolli eest telefilmis "Path to War" nomineeritud Kuldgloobusele, sama rolli eest pälvis ta ka Emmy nominatsiooni. Emmy'dele oli Gambon nomineeritud ka rolli eest 2010. aasta lühisarjas "Emma". Karjääri jooksul võitis ta ka neli BAFTA't aastatel 1987, 2000, 2001 ja 2002.